Callum Lynch (Michael Fassbender) soll wegen Mordes hingerichtet werden, doch kurz bevor das Urteil vollstreckt wird, kommt er im Auftrag der Firma Abstergo Industries in die Einrichtung der Wissenschaftlerin Sophia Rikkin (Marion Cotillard) nach Madrid, wo Menschen mit hohem Gewaltpotenzial geheilt werden sollen. Nur wenig später erfährt Callum jedoch, dass hinter der Organisation des Generaldirektors Alan Rikkin (Jeremy Irons) die moderne Inkarnation des Templerordens steckt. Die Templer wollen den legendären Apfel Edens finden, um damit den freien Willen der Menschheit zu steuern – und Callum soll ihnen dabei behilflich sein. Mittels einer Maschine durchlebt er die Erinnerungen seines Vorfahren Aguilar de Nerha, einem Assassinen zur Zeit der Spanischen Inquisition. Doch während er in der Vergangenheit seine Mission ausführt, erlernt Callum immer mehr Fähigkeiten, die er in der Gegenwart gegen die Templer einsetzen kann…